Fluorescenčna mikroskopija: principi metode

Absorpcija in nadaljnja reeradiacija svetlobe z anorganskimi in organskimi mediji je posledica fosforezence ali fluorescence. Razlika med pojavom je sestavljena iz trajanja intervala med absorpcijo svetlobe in emisijo fluksa. S fluorescenco se ti procesi pojavljajo skoraj istočasno in s fosforescentnostjo - z nekaj zakasnitvijo.

Zgodovinsko ozadje

Leta 1852 je britanski znanstvenik Stokes najprej opisal fluorescenco. Uvedel je nov izraz kot rezultat poskusov z fluorita, ki oddajajo rdečo svetlobo pod vplivom ultravijolične svetlobe. Stokes je opazil zanimiv fenomen. Ugotovil je, da je valovna dolžina s fluorescenčno sevanjejo vedno večja kot pri vzbujanju svetlobnega toka.

Za potrditev hipoteze v 19. stoletju so bili opravljeni številni poskusi. Pokazali so, da različni vzorci fluorescirajo pod vplivom ultravijoličnega. Med materiali, med drugim bili kristali, smole, mineralov, klorofila, surova droge, anorganskih spojin, vitaminov, olja. Neposredna uporaba barvil za izvajanje bioloških analiz se je začela šele leta 1930.

Fluorescenčna mikroskopija: opis

Nekateri materiali, uporabljeni v študijah prve polovice 20. stoletja, so bili zelo specifični. Zahvaljujoč kazalcem, ki jih s kontrastnimi metodami ni mogoče doseči, metoda fluorescenčne mikroskopije je postalo pomembno orodje v biomedicinskih in bioloških raziskavah. Dobljeni rezultati niso bili pomembni za znanost o materialih.

Kakšne so prednosti fluorescenčne mikroskopije?? S pomočjo novih materialov je bilo mogoče izolirati visoko specifične celice in submikroskopske komponente. Fluorescentni mikroskop lahko zazna posamezne molekule. Različne barve omogočajo istočasno prepoznavanje več elementov. Kljub omejeni prostorski ločljivosti opreme z difrakcijsko mejo, ki pa je odvisna od specifičnih lastnosti vzorca, je tudi mogoča odkrivanje molekul pod to stopnjo. Različni vzorci po obsevanju kažejo avtofluorescenco. Ta pojav se pogosto uporablja v petrologiji, botani, polprevodniški industriji.

Značilnosti

Študija živalskih tkiv ali patogenih mikroorganizmov je pogosto zapletena s prešibko ali zelo močno nespecifično avto fluorescenco. Vendar pa je pomen v študijah uvedba materiala sestavin, ki so vzburjene na določeni valovni dolžini in oddajajo svetlobni tok zahtevane intenzitete. Fluorohromi delujejo kot barve, ki se lahko pritrdijo na strukture (nevidne ali vidne). Hkrati so zelo selektivni glede na cilje in kvantni donos.

Fluorescenčna mikroskopija se je pogosto uporabljal s pojavom naravnih in sintetičnih barvil. Imeli so določene profile intenzivnosti emisij in vzbujanja ter bili namenjeni specifičnim biološkim ciljem.

Identifikacija posameznih molekul

Pogosto se v idealnih razmerah lahko registrira sij posameznega elementa. Za to je med drugim treba zagotoviti dovolj nizek detektorski hrup in optično ozadje. Molekula fluorescein pred uničenjem zaradi fototočkov lahko oddaja do 300 tisoč fotonov. Pri 20% zbiranja in učinkovitosti postopka se lahko registrirajo v višini okoli 60 tisoč evrov.

Fluorescenčna mikroskopija, ki temelji na plazovih fotodiodah ali množenju elektronov, je raziskovalcem omogočilo, da opazujejo vedenje posameznih molekul v sekundah in v nekaterih primerih tudi minut.

Težave

Ključni problem je preprečevanje hrupa iz optičnega ozadja. Zaradi dejstva, da veliko materialov, uporabljenih pri oblikovanju filtrov in leč, kaže nekaj avtofluorescence, so se prizadevanja znanstvenikov v začetnih fazah osredotočila na proizvodnjo komponent, ki imajo nizko fluorescenco. Vendar so nadaljnji poskusi pripeljali do novih zaključkov. Zlasti je bilo ugotovljeno, da fluorescenčna mikroskopija, ki temelji na popolnem notranjem razmisleku, omogoča doseganje nizkega ozadja in visoko intenzivnega razburljivega svetlobnega toka.

Mehanizem

Načela fluorescenčne mikroskopije, ki temeljijo na popolnem notranjem razmisleku, sestavljajo uporaba hitro propadajočega ali neplodljivega vala. Nastaja na meji medijev z drugačnimi refrakcijski indeksi. V tem primeru svetlobni žarek prehaja skozi prizmo. Ima visoko refrakcijski indeks.

Prizma je pritrjena na vodno raztopino ali steklo z nizkim parametrom. Če je tok svetlobe usmerjen na to pod kotom, ki je večji od kritične, se svetlobni reflektor v celoti odraža od vmesnika. Ta pojav po drugi strani povzroči neprepusni val. Z drugimi besedami, generira elektromagnetno polje, ki prodre v medij z manjšim refrakcijskim indeksom na razdalji manj kot 200 nanometrov.

V ne-razmnoževalnem valu intenziteta svetlobe bo dovolj, da vzbujajo fluoroforje. Vendar pa bo zaradi izjemno nizke globine njegova prostornina zelo majhna. Posledično se pojavi nizek nivo ozadja.

Sprememba

Fluorescenčna mikroskopija, ki temelji na popolnem notranjem odboru, se lahko realizira s pomočjo epi osvetlitve. To zahteva leče s povečano številčnico (vsaj 1,4, vendar je zaželeno, da doseže 1,45-1,6), kot tudi delno osvetljeno polje naprave. Slednje dosežemo z uporabo majhne velikosti. Za večjo izenačenost se uporablja tanek obroč, skozi katerega se blokira del pretoka. Za pridobitev kritičnega kota, po katerem se pojavi celoten odboj, je potrebna visoka stopnja refrakcije potapljaškega medija v lečah in pokrov stekla mikroskopa.