Molekularno-biološke metode raziskovanja in njihove uporabe

Molekularno-biološki raziskovalne metode

Molekularne biološke metode preiskave. Kaj je to?

Že v sedemdesetih in osemdesetih letih prejšnjega stoletja so znanstveniki prvič človeško genomsko dešifrirali. Ta dogodek je spodbudil razvoj genetskega inženirstva in molekularne biologije. Študija lastnosti DNA in RNK je pripeljala do dejstva, da je zdaj mogoče uporabiti te nukleinske kisline, da bi diagnosticirali bolezen, preučevali gene.

Priprava DNA in RNA

Molekularno-biološki diagnostične metode zahtevajo prisotnost izhodnega materiala: pogosteje so nukleinske kisline. Obstaja več načinov izoliranja teh snovi iz celic živih organizmov. Vsaka od njih ima svoje prednosti in slabosti, kar je treba upoštevati pri izbiri metode izolacije nukleinskih kislin v čisti obliki.

1. Priprava DNA po Marmurju. Metoda obsega obdelavo mešanice snovi z alkoholom, zaradi česar se čista DNA obori. Pomanjkljivost te metode je uporaba agresivnih snovi: fenola in kloroforma.

2. DNK izolacija z Boom. Osnovna snov, ki se tukaj uporablja, je gvanidin tiocianat (GuSCN). Spodbuja padavine deoksiribonukleinska kislina na specializirane podlag, iz katerih se lahko nato zbrani s pomočjo posebnega pufra. Vendar GuSCN - je zaviralec TCP in celo majhen delež, ki dobi deponira v DNK lahko vplivajo na potek verižne reakcije s polimerazo, kar je pomembno pri delu z nukleinskih kislin.

3. Padec nečistoč. Metoda se razlikuje od prejšnjih, saj ne precipitirajo molekule same deoksiribonukleinske kisline, ampak nečistoče. Za to uporabite ionske izmenjevalce. Pomanjkljivost je, da vse snovi ne morejo oboriti.

4. Masovni pregled. Ta metoda se uporablja v tistih primerih, ko natančne informacije o sestavi molekule DNA niso potrebne, vendar je treba pridobiti nekatere statistične podatke. To je posledica dejstva, da se struktura nukleinske kisline poškoduje z obdelavo z detergenti, zlasti z alkalijami.

Klasifikacija raziskovalnih metod

Vse molekularne biološke metode raziskovanja so razdeljene v tri velike skupine:

1. Ojačitev (z uporabo različnih encimov). To vključuje verižno reakcijo s PCR - polimerazo, ki igra veliko vlogo pri številnih diagnostičnih metodah.

2. Neuporaba. Ta skupina metod je neposredno povezana z delovanjem zmesi nukleinskih kislin. Primeri so tri vrste blotiranja, in situ hibridizacija itd.

3. Metode, ki temeljijo na prepoznavanju signala iz molekule sonde, ki se veže na določeno sondo DNA ali RNA. Primer je sistem hibridizacije v rešitvi Hybrid Capture System (hc2).

Encimi, ki se lahko uporabljajo v molekularnih bioloških metodah

Številne metode molekularne diagnostike vključujejo uporabo številnih encimov. Spodaj so najpogosteje uporabljene:

1. Restrictase - "zmanjša" molekulo DNA v potrebne dele.

2. DNA polimeraza - sintetizira dvojno vijačno molekulo deoksiribonukleinske kisline.

3. Povratna transkriptaza (revertaza) - se uporablja za sintetiziranje DNA na matriki RNA.

4. DNA ligaza - odgovorna za nastanek fosfodiesternih vezi med nukleotidi.

5. Eksonukleaza - odstranjuje nukleotide iz končnih odsekov molekule deoksiribonukleinske kisline.

PCR je glavni način za ojačitev DNK

Polimerazna verižna reakcija (PCR) se aktivno uporablja v sodobni molekularni biologiji. To je metoda, v kateri lahko pridobimo ogromno število izvodov iz ene molekule DNA (ojačimo molekule).

Glavne funkcije PCR so:

- diagnostika bolezni;

- kloniranje DNA, genov.

Za izvedbo polimerazne verižne reakcije zahteva naslednje elemente: začetna molekule DNA, termostabilno DNA-polimerazo (Taq ali Pfu), deoksinukleotid fosfati (viri dušikovih baz), primerji (začetni oligonukleotid 2 1 Molekula DNA) sama varovalni sistem, v kateri so možne vse reakcije.

PCR je sestavljen iz treh stopenj: denaturacije, žarjenja pragov in raztezanja.

1. Denaturacija. Pri temperaturi 94-95 stopinj Celzija se nadaljuje prekinitev vodikovih vezi med dvema pramenama DNA in posledično dobimo dve molekuli ene verige.

2. Odzračevanje temeljnih premazov. Pri temperaturi 50-60 stopinj Celzija so na koncih enojnih molekul nukleinske kisline pritrjeni primerji z vrsto komplementarnosti.

3. Raztezek. Pri temperaturi 72 stopinj se pojavi sinteza hčerinskih dvojnih molekul deoksiribonukleinske kisline.

Zaporedje DNA

Molekularne biološke metode pogosto zahtevajo poznavanje zaporedja nukleotidov v molekuli deoksiribonukleinske kisline. Določiti genetski kod Sekvenciranje se izvaja. Molekularna diagnostika prihodnosti bo temeljila na znanju, pridobljenem pri določanju zaporedja osebe.

Razlikujejo se naslednje vrste zaporedja:

• zaporedje Maxam-Gilbert;
• zaporedje Sangerja;
• pirosequencing;
• nanoporozno sekvenciranje.