Molekularna diagnostika: PCR v realnem času

Trenutno je v molekularni diagnostiki razvit mehanizem polimerazno verižno reakcijo (PCR), kar je spodbuda za razvoj velikega števila metode diagnoze bolezni, ki temeljijo na opredelitvi genskega materiala. Za izvedbo PCR v realnem času, fragment genov (zlasti nukleinska kislina) povzročitelj bolezni, ki se ne pojavi pri drugih posameznikih.

Načelo PCR je množenje določenega DNA fragmenta patogena v milijonih krat z uporabo DNA polimeraze v posebni napravi, imenovani termični cikler, ki zagotavlja ciklično ponovitev temperaturnega režima glede na določen program.

Diagnoza PCR omogoča ponovitev serije ojačitev, ki ohranja aktivnost encima. Ko ojačanje poteka neovirano, se v enem ciklu število kopij določenega območja patogene DNA podvoji, po tridesetih ciklusih - sto-desetkrat. Zato se PCR uporablja pri diagnozi za določitev dovolj majhnih patogenov, katerih odkrivanje brez tega ni mogoče.

Opozoriti je treba, da RNA ne more biti matrika za PCR v realnem času. Zato je za odkrivanje virusne RNK potrebno, preden se ojača, pridobiti DNK, ki ustreza njenemu fragmentu. Verižna reakcija v polimerazi omogoča merjenje DNA in RNA patogena. Tako pridobljeni podatki se uporabljajo za spremljanje učinkovitosti uporabljenega terapije in za oceno klinične prognoze.

Poleg tega PCR v realnem času ne potrebuje dodatnih ukrepov za dešifriranje preučenih DNA ali amplikonov, ki ovirajo pravilno diagnozo in vodijo do napačnih rezultatov. Ta pristop nam omogoča, da ne uporabljamo faze elektroforeze, kar vodi k zmanjšanju tveganja okužbe s produkti verižne reakcije s polimerazo. Tudi v povezavi z zmanjšanjem števila manipulacij s patogenom se čas študije zmanjša, njen proces je poenostavljen in verjetnost napak se zmanjša. PCR omogoča tudi določitev začetnega števila DNA kopij patogena v kliničnem preskušanju, ki pomaga določiti obdobja poslabšanja bolezni in pravočasno ukrepati za zdravljenje bolnika.

Do sedaj je v realnem času na voljo veliko načinov za ojačitev. Najpogosteje se uporabljajo različne tehnike, ki uporabljajo radiokemične korelirane sonde, katerih intenzivnost sevanja se spreminja z akumulacijo amplikona in se v realnem času zabeleži z uporabo posebne naprave, imenovane ojačevalnik z optičnim modulom. To zagotavlja visoko stopnjo občutljivosti analize. V tem primeru je mogoče zaznati produkt PCR skupaj z ogromno količino stranskih produktov, medtem ko pri uporabi elektroforeze pogosto ni opaziti.

Pri PCR se v realnem času uporabljajo pozitivni, kontrolni in negativni vzorci. Tako se pozitivni in negativni vzorci med študijo analizirajo kot ločeni vzorci, kontrolni vzorec se nato doda vsakemu takemu vzorcu in poteka skozi vse faze analize.

Do danes obstaja veliko število instrumentov za polimerazna verižna reakcija. Ti vključujejo Bio-Rad, Applied Biosystems, Cepheid ali Roche. Vsak od njih ima zasluge in slabosti

Treba je opozoriti, da je PCR diagnostična metoda, ki se uporablja v velikih znanstvenih, raziskovalnih in diagnostičnih centrih po vsem svetu, saj omogoča takojšnjo interpretacijo dobljenih rezultatov.