Molekularna genetska metoda preiskave

Za preučevanje in identifikacijo variant v strukturi DNK uporabljamo molekularno genetsko metodo. Za vsako preučeno območje DNA je regija kromosom, gen ali alel, metode so drugačne. V središču vsake molekularne genetske metode vsebuje nekaj manipulacije RNA in DNA. Vse te metode so zelo zapletene, brez laboratorijskih pogojev ni mogoče izvesti, osebje pa mora biti visoko usposobljeno. To delo se izvaja v več fazah.

Faze

Najprej je treba pridobiti vzorce RNA ali DNA. Tu lahko genetski metode molekularne se uporablja za praktično vsak material: kapljico krvi, levkocitov, fibroblasti kulture, sluznico (nepotrebno), celo lasnih mešičkov, - DNA lahko dobimo iz vsakega vzorca. Primeren je za uporabo molekularnih genetskih metod in njihovih različnih variant, in že dodeljena DNA se dolgo časa shranjuje v zmrzovanju. Druga stopnja je namenjen kopičenju želenimi fragmentov (pomnoževanje) DNA, saj pomaga zagotoviti polimerazne verižne reakcije in vitro (in vitro brez udeležbe živem organizmu). Posledično se izbrani DNA fragment pomnoži s to verižno reakcijo, količina DNK pa se dobesedno poveča milijonkrat.

Tretja stopnja molekularnih genetskih metod preiskave je omejevanje pomnožene DNA (to je razdrobljenost, trganje ali rezanje). Omejitev se opravi s poliakrilamidno ali agarozno gelsko elektroforezo. Ta molekularna genetska metoda za proučevanje DNK omogoča, da vsak fragment zasede določen položaj v gelu. Po tem se gel obdeluje z etidijevim bromidom, ki se lahko veže v DNK, izvaja se ultravijolično obsevanje, po katerem je mogoče opazovati področja luminiscence. Molekularne genetske metode diagnoze so raznolike in številne, vendar so prve dve stopnji tipične za vse. Toda za identifikacijo fragmentov DNK je lahko gel obarvan z mnogimi drugimi obstoječimi metodami.

Sorte

Najbolj neposredne in razširjene metode za odkrivanje mikobakterij vključujejo zgoraj opisano molekularno-genetsko metodo za proučevanje DNK. Njeno bistvo je razkritje določenih fragmentov verige patogenov DNA v diagnostičnih materialih. Molekularne genetske metode diagnoze še nimajo učinkovitejšega načina prepoznavanja takšne bolezni kot tuberkuloze. Uporaba polimerazne verižne reakcije (PCR) ste lahko prepričani, da bo izvirna DNA povečala število kopij v milijonih krat, to pomeni, da bo prišlo do ojačitve, kar bo omogočilo vizualizacijo rezultatov. Stopnja občutljivosti je tukaj zelo visoka - več kot devetindevetdeset odstotkov, kar je glavna prednost te metode.

Preostali del molekularno genetskih metod raziskav o učinkovitosti donosom več kopij dobesedno podvojila, saj je v tem primeru priprava vzorca kaže posebno oligonukleotid sekvenco poveča na sto šestkrat. Celo kulturna diagnoza tuberkuloze dihalnih organov je v svoji občutljivosti precej nižja. Zato sodobna medicina temelji na molekularnih genskih metodah za diagnosticiranje tuberkuloze. Opisana metoda je še posebej učinkovita pri sestanku s patogeni visoke antigenske variabilnosti, da bi ugotovili, kateri je na drugi način veliko težji - poseben hranilni mediji in dolgo časa gojenja. Biokemijske in molekularne genetske metode dajejo popolnoma drugačne učinke.

Diagnoza tuberkuloze

Najpogosteje konstruirajo PCR diagnostiko tuberkuloze z uporabo teh zaporedij DNA, ki so specifične za vse štiri vrste te bolezni. Za dosego tega cilja pogosto uporabljajo oligonukleotidov, ki zaznavajo zaporedje elementov (IS-986, IS-6110), saj ti elementi zaznamujejo izrazito selivske vrste Mycobacterium tuberculosis in vedno prisotna več kopij v genomu. Tudi DNK je mogoče izločiti iz čistih kultur in kliničnih (sputum pacientov) s katero koli drugo sprejemljivo metodo. Na primer, obstaja metoda Boom, ki uporablja lizni pufer na osnovi gvanidina, silicijevega dioksida in tiocianata kot nosilca DNA. Število bolnikov, ki se razlikujejo slabo bakteriološko vsako leto povečuje, zato je v klinični praksi uveljavljenih povsem drugačno raven organizacije: molekularno-genetska metoda študija DNK je bila igra pomembno vlogo pri diagnozi.

Vendar pa moramo priznati, da ni brez napak. Uporaba metode PCR pogosto prinaša ogromno lažno pozitivnih rezultatov, pri čemer gre tu za napako ne le tehnične napake, temveč tudi posebnosti same metode. Med drugim je uporaba te metode diagnoze za določitev stopnje sposobnosti preživetja mikobakterij, ki so opredeljene, preprosto nemogoče. Toda ta pomanjkljivost ni najpomembnejša. Molekularne genetske metode diagnostike PCR pomenijo nevarnost kontaminacije mikobakterijske DNK. Zahteve za certifikacijo iz tega razloga za laboratorije PCR so izjemno toga, zahtevajo prisotnost treh izoliranih sob. PCR tehnologija je sodobna in zelo zapletena, za njeno uporabo pa potrebuje ustrezno opremo in visoko usposobljeno osebje.

Bakterioskopija

Pri ugotavljanju diagnoze je treba rezultate testa PCR nujno primerjati z ostalimi podatki: klinični pregled, radiografija, mikroskopija s posipom, setev in celo odziv na posebno zdravljenje so zelo pomembni tukaj. V tem nizu študij je PCR le ena izmed komponent. Odkrivanje patogena na samem začetku diagnoze je lahko najbolj preprosta in hitra metoda - bakteriološka.

Tukaj uporabljamo svetlobni mikroskop (barva Tsiol-Nielsen) in luminescentno (fluorochrome obarvanje). Prednost bakterioskopije je hitrost, s katero dobimo rezultate. Slabost tega je omejena možnost zaradi nizke občutljivosti. Vendar pa je ta metoda, ki jo WHO priporoča kot najbolj ekonomično in osnovno za ugotavljanje bolnikov s tuberkulozo. Odkrivanje mikobakterij po bakteriološki metodi ima vrednost napovedi in sproščanje bakterij je količinsko opredeljeno. Molekularne genetske metode proučevanja tuberkuloze so s tem veliko bolj samozavestne.

Kulturne raziskave

Najboljše odkrivanje mikobakterij priznavajo študije kulture. Setev patološkega materiala se izvaja v jajčnih medijih: Mordovsky, Finn II, Levenshtein-Jensen in podobno. Indikativni ukrep za razvoj odpornosti mikobakterij na zdravila in posredne dokaze o učinkovitosti je količina mikobakterij ali njihovih kolonij in vitro, če se uporablja kultivna metoda preiskave. Za povečanje odstotka dodelitve mikobakterij se patološki material poseže v več medijev.

Zadovoljujoč številnim kulturnim potrebam je povzročitelju zagotovljen tudi tekoči medij. Hkrati se uporabljajo avtomatizirani sistemi obračunavanja rasti tipa VANTES. Pridelke je treba inkubirati do sedem do osem tednov. V tem času sejanje s pomanjkanjem rasti lahko šteje za negativno. Najbolj učinkovit način za odkrivanje mikobakterijske tuberkuloze je biološki testi: okužijo diagnostični material morskih prašičkov, ki so izjemno občutljivi na tuberkulozo.

Nekaj ​​številk

Najbolj zanimivo področje raziskav, ki je bilo odkrito z diagnostiko PCR, je bila študija M. tuberculosis, latentne okužbe. Sodoben koncept okužbe s tuberkulozo kaže na to, da je od sto ljudi, ki so bili v stiku z M. tuberculosis, lahko okuženi devetdeset, vendar jih ima le 10 aktivne bolezni. Preostali so imunski imunski odziv in zato v devetdeset odstotkih primerov okužba ostane latentna. To je bila molekularna genetska metoda, ki je pripomogla k odkrivanju tega vzorca.

Genetiki rekli, da petinpetdeset odstotkov tistih, katerih pridelek patološko materiala so bili negativni, in osemdeset odstotkov ljudi, okuženih z M. tuberculosis, vendar teče brez radiografsko manifestacije bolezni, prejetih PCR pozitivni odzivi. To je genetska diagnostična metoda pomagala odkriti bolnike ogroženi s študijami PCR, z rezultati svojih analiz (mikroskopije in kultura) so bili negativni, in subklinično okužbo z M. tuberculosis bila prisotna.

Sodobne raziskave

Bakteriološki laboratoriji Ruske federacije uporabljajo pospešeno metodo absolutnih koncentracij: aktivnost nitratne reduktaze mikobakterij testiramo z reagentom Griss. Centri proti tuberkulozi uporabljajo metodo, ki omogoča določanje odpornosti na zdravila. To je kultura v tekočih medijih, kjer je radiometrični in fluorescentni sistem za beleženje rasti mikobakterij avtomatiziran. Takšna analiza se opravi hitro - do dva tedna.

Trenutno se razvijajo nove metode: odpornost mikobakterij na zdravila se ocenjuje na ravni genotipa. Študija molekularnih mehanizmov odpornosti kaže prisotnost genov v mikobakteriji. Ti geni so povezani z odpornostjo na določena zdravila. Na primer, kasa genov, inhA, katG odporna na isoniazida, rpoB gena - rifampicin 16Sp RNA genih in rpsl - streptomicin, emb1 - do ethambutola, gyrA - fluorokinolonsko in tako naprej.

Mutacije

V sodobni diagnostiki se je molekularna genetska raven metode DNA znatno povečala in omogočila obsežno študijo mutacij v celotnem spektru. Zdaj vemo, da so mutacije v 516, 526 in 531 kodonih gena rpoB najpogostejše, in ugotovljena je bila odpornost proti različnim zdravilom. Obstaja vrsta metod za tipizacijo mikobakterij z uporabo ne samo tradicionalnih metod - biokemičnih, bioloških in kulturnih, temveč se pogosto uporabljajo sodobne molekularne genetske metode. Že obstajajo primerne in zanesljive diagnostične metode za odkrivanje monogenih bolezni. Temeljijo na raziskavah DNA v natančni regiji določenega gena. To je ponavadi zapleten proces, dolgotrajen in drag, vendar so podatki, ki jih zagotavljajo metode molekularne genetske analize, mnogo bolj natančni in informativni kot podatki vseh drugih analiz.

Že dolgo je znano, da se DNK ne spremeni za vse življenje organizma, da je v vsakem celic z jedri odnakova, kar omogoča, da se z analizo absolutno vse celice v telesu, v kateri koli fazi zorenjem. Poškodovanih gen je mogoče odkriti pred pojavom prvih simptomov do kliničnih znakov bolezni v polnem obsegu, kot tudi pri zdravih heterozigotnih ljudi, vendar imajo mutacijo v genu. Molekularna genetsko dedna bolezen diagnostične metode omogočajo, da razkrije svoje (z neposrednim stikom, DNA diagnostika), kot tudi za analizo ločitve bolezni v družini z dvojno podajo loci DNK (genetskih polimorfizmov), ki so tesno povezane s poškodovanim genom (tj, posredni pristop od DNK diagnostiko). Neposredna ali posredna - vsaka diagnoza DNA temelji na metodah, ki opredeljujejo strogo opredeljeno področje človeške DNK.

Neposredne metode

Neposredne metode diagnostike DNK se uporabljajo v primerih, ko je gen-krivec dedne bolezni znan, vrste njihovih mutacij pa so znane tudi. Na primer, neposredne metode so primerne za različne bolezni. To je Huntingtonova horea (ekspresija CTG), fenilketonurija (R408W), cistične fibroze (delF508, glavne mutacije) in podobno. Glavna prednost neposredne metode je sto odstotna natančnost diagnoze in ni potrebe po analizi DNK preostale družine. Če se odkrije mutacija v ustreznem genu, vam omogoča, da natančno potrdite diagnozo dednosti, določite genotip za preostalo obremenjeno družino.

Druga prednost neposredne diagnoze je odkrivanje heterozigotnega prevoza slabih mutacij pri sorodnikih in starših umrlih od bolezni. To še posebej velja za bolezni avtosomalnih recesivov. Na voljo so tudi pomanjkljivosti neposrednih metod. Da jih uporabite, morate natančno vedeti o lokalizaciji patološkega gena, ekson-intronski strukturi in spektru njenih mutacij. Danes niso prejele nobenih monogenih bolezni. Informativnost neposrednih metod ni mogoče šteti za popolno, saj lahko isti gen vsebuje veliko število patoloških mutacij, ki določajo razvoj dednih bolezni.

Posredne metode

Posredne metode v diagnostiki DNK se uporabljajo na vseh, v drugih primerih, če je poškodovan gen ni opredeljen, vendar le kromosomsko ali če linija diagnoza ni dal rezultata (to se zgodi, če, če obstaja gen kompleks molekularno organizacijo ali veliki meri veliko patološke mutacije). Posredne metode se uporabljajo za analizo segregacije polimorfnih markerjev v družini alelov. najdenih v isti kromosomske regije ali lokus Markerji je tesno povezana z boleznijo in pomenita delecije ali insercije, točka substitucije ponavlja, in njihova polimorfizem je zaradi različne količine celic v bloku.

Najbolj primerna za posredno diagnozo so mikrosatelit in minisatellite polimorfni markerji, ki so široko porazdeljeni v človeškem genomu. Njihova vrednost se izraža v visoki informativnosti, če genetska razdalja med poškodbo v genu in markerjem ni prevelika. V slednjem primeru je natančnost ocene v veliki meri odvisna od frekvence rekombinacije med polimorfnim markerjem in lezijo. Neposredni diagnostične metode tudi obvezno predhodno stopnjo alelov frekvencah analiziranega populacijski študiji med bolniki in nosilcev mutacij, plus nujnost določanje verjetnosti rekombinacije neravnovesni in adhezijo označevalcev in mutiranih alelov.

Druge metode

Kratek segmenti RNK ali DNK in en sam gen ni mogoče vizualizirati z mikroskopskim pregledom, zato je za identifikacijo mutacij potrebnih metod molekularne genetske diagnostike. Obstoječi projekt "Human Genome Project", tako kot drugi dosežki v molekularni genetiki, je v mnogih pogledih razširil možnost diagnosticiranja dednih bolezni, tako pred in po postnatalnem. Te metode lahko zagotovijo zgodnje odkrivanje in napovedovanje poli in monogenih bolezni, v katerih se prvenec zgodi v odrasli dobi. Na žalost, z vidika tehničnih zmožnosti, molekularne genetske študije včasih presegajo etične okvire, ki se vzpostavljajo glede na dediščino, še posebej, če se diagnosticiranje izvaja v adolescenci in otroštvu.

Strukturne in kvantitativne anomalije kromosomov so najpogostejši vzroki tako onkoloških bolezni kot številnih razvojnih anomalij. Ugotoviti je treba kromosomske aberacije, kar je pomembno za družinsko svetovanje - oceniti napoved skupaj z reproduktivnim tveganjem v prihodnjih nosečnostih. Kromosomska analiza je "zlati standard" genetske diagnoze, vendar ima tudi omejene možnosti. Samo metode molekularna genetska analiza lahko naredijo več, ker uporabljajo fluorescentne nalepke, ki temeljijo na tehnologijah kloniranja, so sposobne zaznati s svojo visoko občutljivostjo subtilne kromosomske spremembe, ki jih ni mogoče zaznati s klasičnimi citogenetske raziskave. Te tehnike vedno bolj širijo naše diagnostične sposobnosti, ko se preučujejo otroci z motnjami v razvoju, z duševno zaostalostjo in številnimi drugimi dednimi boleznimi.

Sklepi

To je zelo pomembno za človeštvo so genska struktura in funkcija znanja, tipi variabilnosti, sposobnost za odkrivanje dednih bolezni, ki so se pojavile v zvezi z razvojem molekularne genetike. Njegove metode so namenjene preučevanju molekule DNA - in kadar je to normalno in če je poškodovano. Priprava nukleotidnih zaporedij deoksiribonukleinske kisline (DNK) postopoma prehaja iz priprave vzorcev do identifikacije posameznih fragmentov. Izolacija genomske DNA iz celic, omejitev (trganje), ojačanja (kloniranje), elektroforezo od fragmentov (ločevanjem električni naboj in molekulsko maso z elektroforezo v agaroznem gelu). Določitev nekaterih fragmentov, ki se nahajajo na svoji površini z diskretnim trakom.

Nato dobili v akt posebnih filtrov, skozi katero prehaja vsak fragment hibridizacijo s kloniranimi DNA fragmentov ali sintetičnih radioaktivnih sond je kontrola, ki bo enak vsak testni vzorec. Če spremenite položaj ali dolžino v primerjavi s sondo, če nov fragment ali izginila - vse to kaže, da je analizirala gen doživela prestrukturiranje v zaporedju nukleotidov. Obstaja osem osnovne tehnike molekularne genetske študije: zaporedja (določitev zaporedja DNA), verižne reakcije s polimerazo (povečanje števila zaporedij), priprava oligonukleotidnih znanih genov, kloniranje DNA, produkcija rekombinantnih molekul pridobljene beljakovine zaradi rekombinantnih molekul, ki ustvarja celoto (zbiranje knjižnica) kloniranih fragmentov, ki so bili pridobljeni z omejitvijo.