Imobilizirani encimi in njihova uporaba

Prvič je koncept imobiliziranih encimov nastal v drugi polovici 20. stoletja. Medtem, že leta 1916 je bilo ugotovljeno, da saharoza, sorbirana na ogljiku, ohranja svojo katalitsko aktivnost. Leta 1953, D. N. Shleyt Grubhofer izvedena prva vezavna pepsin, amilaze v karboksipeptidaza in RNaza na netopno nosilcem. Koncept imobiliziranih encimov je bil legaliziran leta 1971. To se je zgodilo na prvi konferenci o inženirski enzimologiji. V tem trenutku koncept imobiliziranih encimov

Splošne informacije

Inimobilizirani encimi - spojine, ki so umetno vezane na netopen nosilec. Istočasno ohranjajo svoje katalitične lastnosti. Trenutno se ta proces obravnava v dveh vidikih - v okviru delne in popolne omejitve prostega gibanja beljakovinskih molekul.

Prednosti

Znanstveniki so ugotovili nekatere prednosti imobiliziranih encimov. Delujejo kot heterogeni katalizatorji, se lahko zlahka ločijo od reakcijskega medija. Kot del raziskave je bilo ugotovljeno, da uporaba imobiliziranih encimov je lahko večkrat. Med procesom vezanja spojine spremenijo svoje lastnosti. Pridobijo specifičnost substrata, stabilnost. Hkrati pa je njihova dejavnost začela odvisna od okoljskih pogojev. Imobilizirani encimi se odlikujejo po njihovi trajnosti in visoki stopnji stabilnosti. To je več kot, na primer, proste encime v tisočih, več deset tisočkrat. Vse to zagotavlja visoko učinkovitost, konkurenčnost in ekonomičnost tehnologij, v katerih so prisotni imobilizirani encimi.

Mediji

J. Poratu je opredelil ključne lastnosti idealnih materialov, ki jih je treba uporabiti za imobilizacijo. Mediji morajo imeti:

1. Netopljivost.
2. Visoka biološka in kemična odpornost.
3. Sposobnost hitrega aktiviranja. Prevozniki se morajo preprosto preoblikovati v reaktivne vrste.
4. Pomembna hidrofilnost.
5. Potrebna prepustnost. Njegov indeks mora biti enako sprejemljiv za encime, za koencime, reakcijske produkte in substrate.

Trenutno ni nobenega gradiva, ki v celoti izpolnjuje te zahteve. Kljub temu se v praksi uporabljajo nosilci, ki so primerni za imobilizacijo določene kategorije encimov pod določenimi pogoji.

Razvrstitev

Glede na njihovo naravo so materiali, v zvezi s katerimi se pretvorijo spojine imobilizirani encimi, so razdeljeni na anorganske in organske. Vezava številnih spojin poteka s polimernimi nosilci. Ti organski materiali so razdeljeni v 2 razreda: sintetični in naravni. V vsakem od njih se nato skupine razlikujejo glede na strukturo. Anorganski nosilci so v glavnem sestavljeni iz stekla, keramike, gline, silikagela, grafitne črne barve. Pri delu z materiali so metode suhe kemije priljubljene. Imobilizirani encimi dobimo s prevleko nosilcev s folijo titanov oksid, aluminij, cirkonij, hafnij ali predelava z organskimi polimeri. Pomembna prednost materialov je enostavnost regeneracije.

Proteinski nosilci

Najbolj priljubljeni so lipidni, polisaharidni in beljakovinski materiali. Med slednjimi je vredno poudariti strukturne polimere. Med njimi so predvsem kolagen, fibrin, keratin, kot tudi želatina. Taki proteini so široko porazdeljeni v naravnem okolju. Cenovno ugodni in ekonomični. Poleg tega imajo veliko število funkcionalnih skupin za vezavo. Proteini se razlikujejo po sposobnosti biorazgradljivosti. To omogoča razširitev aplikacije imobilizirani encimi v medicini. Medtem pa obstajajo tudi negativne lastnosti beljakovin. Slabosti uporabe imobiliziranih encimov na nosilcih proteinov so visoka imunogenost slednje, pa tudi možnost, da se v reakcijo vključijo le nekatere skupine.

Polisaharidi, aminosaharidi

Od teh materialov se najpogosteje uporabljajo kitin, dekstran, celuloza, agaroza in njihovi derivati. Če so polisaharidi bolj odporni proti reakcijam, so njihove linearne verige navzkrižno povezane z epiklorohidrinom. Različne ionogene skupine se prosto vstavijo v mrežaste strukture. Chitin se nabira v velikih količinah v obliki odpadkov med industrijsko predelavo kozic in rakov. Ta snov je kemično odporna in ima dobro definirano porozno strukturo.

Sintetični polimeri

Ta skupina materialov je zelo raznolika in dostopna. Vključuje polimere na osnovi akrilne kisline, stirena, polivinil alkohol, poliuretanski in poliamidni polimeri. Večina se razlikuje po mehanski moči. V procesu preoblikovanja omogočajo spreminjanje velikosti por v dovolj širokem obsegu, uvedbo različnih funkcionalnih skupin.

Načini vezave

Trenutno obstajata dve bistveno drugačni različici imobilizacije. Prvi je priprava spojin brez kovalentnih vezi z nosilcem. Ta metoda je fizična. Druga možnost vključuje nastanek kovalentne vezi z materialom. To je kemična metoda.

Adsorpcija

Z njo imobilizirani encimi pridobljen z ohranitvijo zdravila na nosilni površini zaradi disperzije, hidrofobnih, elektrostatične interakcije in vodikove vezi. Adsorpcija je bila prvi način omejevanja gibljivosti elementov. Vendar pa ta možnost še ni izgubila pomembnosti. Poleg tega se adsorpcija šteje za najpogostejši način imobilizacije v industriji.

Značilnosti metode

V znanstvenih publikacijah je opisanih več kot 70 encimov, pridobljenih z adsorpcijsko metodo. Nosilci so bili predvsem porozno steklo, različne gline, polisaharidi, aluminijev oksid, sintetični polimeri, titan in druge kovine. Slednje se najpogosteje uporabljajo. Učinkovitost adsorpcije zdravila na nosilcu je odvisna od poroznosti materiala in specifične površine.

Mehanizem delovanja

Adsorpcija encimov na netopnih materialih je preprosta. To dosežemo tako, da kontaktirate vodno raztopino zdravila z nosilcem. To se lahko izvaja statično ali dinamično. Encimsko raztopino pomešamo s svežo oborino, npr. Z titanovim hidroksidom. Potem, pod blagimi pogoji, spojino posušimo. Encimska aktivnost s to imobilizacijo je skoraj 100%. Hkrati specifična koncentracija doseže 64 mg na gram nosilca.

Negativni trenutki

Pomanjkljivosti adsorpcije vključujejo majhno jakost pri vezavi encima in nosilca. V procesu sprememb reakcijskih pogojev, izgube elementov, kontaminacije proizvodov, desorpcije beljakovin lahko opazimo. Za povečanje trdnosti lepljenja so bili prevozniki predhodno spremenjeni. Zlasti se materiali obdelujejo s kovinskimi ioni, polimeri, hidrofobnimi spojinami in drugimi polifunkcionalnimi sredstvi. V nekaterih primerih je sprememba podvržena samemu zdravilu. Toda to pogosto vodi do zmanjšanja aktivnosti.

Vključitev v gel

Ta možnost je precej pogosta zaradi svoje edinstvenosti in preprostosti. Ta metoda je primerna ne le za posamezne elemente, temveč tudi za komplekse multienzimov. Vključitev v gel lahko izvedemo na dva načina. V prvem primeru pripravek kombiniramo z vodno raztopino monomera, čemur sledi polimerizacija. Kot rezultat se pojavi prostorska struktura gela, ki vsebuje molekule encima v celicah. V drugem primeru priprave dodamo k raztopini končnega polimera. Nato se prenese v stanje gela.

Vdelava v polprozorne strukture

Bistvo te metode imobilizacije je ločevanje vodne raztopine encima iz substrata. Za to se uporablja polprepustna membrana. Prehaja nizko-molekularne elemente kofaktorjev in substratov ter zamuja velike molekule encimov.

Mikrokapsulacija

Obstaja več možnosti za uvedbo v pol transparentne strukture. Največji interes so mikrokapsulacija in vključevanje proteinov v liposome. Prva različica je leta 1964 predlagal T. Chang. Sestoji iz dejstva, da se encimska raztopina vnese v zaprto kapsulo, katere stene so izdelane iz polprepustnega polimera. Videz membrane na površini je posledica reakcije medfazne polikondenzacije spojin. Ena od njih se raztopi v organskih, in druga - v vodni fazi. Kot primer lahko navedemo nastanek mikrokapsule dobljenih s polikondenzacijo sebacinsko halida kisline k-ti (Organsko fazo) in 1,6-heksametilendiamin (oziroma, vodno fazo). Debelina membrane se izračuna v stotinah mikrometra. V tem primeru je velikost kapsul stotine ali deset mikrometrov.

Vključitev v liposome

Ta metoda imobilizacije je blizu mikrokapsulaciji. Liposomi so zastopani v lamelnih ali sferičnih sistemih lipidnih dvoslojev. Ta metoda je bila prvič uporabljena leta 1970. Izhlapevanje organskega topila se izvaja za izolacijo liposomov iz lipidne raztopine. Preostali tankoslojni film je dispergiran v vodni raztopini, v kateri je encim prisoten. Med tem procesom se odvija samo-sestavljanje lipidnih dvoslojnih struktur. Precej priljubljena so taka imobilizirani encimi v medicini. To je posledica dejstva, da je večina molekul lokalizirana v lipidni matrici bioloških membran. Vključeno v liposome imobilizirani encimi v medicini so najpomembnejši raziskovalni materiali, ki omogočajo preučevanje in opisovanje zakonov življenjskih procesov.

Oblikovanje novih povezav

Imobilizacija s formiranjem novih kovalentnih verig med encimi in nosilci velja za najbolj masovno metodo za pridobivanje industrijskih biokatalizatorjev. Za razliko od fizičnih metod, ta možnost omogoča nepopravljivo in močno vez med molekulo in materialom. Njeno izobraževanje pogosto spremlja stabilizacija zdravila. Istočasno pa lokacija encima na razdalji prve kovalentne vezi glede na nosilec povzroča določene težave pri izvajanju katalitskega procesa. Molekula je ločena od materiala z vložkom. Poli-in bifunkcionalna sredstva pogosto delujejo tako. So zlasti so hidrazin, cianogen bromid, glutaraldehid dialgedrid, sulfuril klorid in tako naprej. Na primer, za pridobivanje galaktoziltransferaze encima iz medijev in naslednje zaporedje vstavi -CH₂-NH- (CH₂)₅-CO-. V takšni situaciji je v strukturi vložek, molekula in nosilec. Vsi so povezani s kovalentnimi vezmi. Bistvenega pomena je potreba po uvedbi reakcijskih funkcionalnih skupin, ki niso nujne za katalitično funkcijo elementa. Torej, praviloma so glikoproteini vezani na nosilec ne skozi protein, temveč skozi ogljikov hidratni del. Kot rezultat, bolj stabilen in aktiven imobilizirani encimi.

Celice

Zgoraj opisane metode veljajo za univerzalne za vse vrste biokatalizatorjev. Med njimi so med drugim tudi celice, subcelularne strukture, katerih imobilizacija je v zadnjem času postala razširjena. To je posledica naslednjega. Pri imobilizaciji celic ni potrebe po izolaciji in čiščenju encimskih pripravkov, da uvajamo kofaktorje v reakcijo. Kot rezultat, postane mogoče pridobiti sisteme, ki izvajajo večstopenjske, neprekinjene procese.

Uporaba imobiliziranih encimov

V veterini, industrija, drugi gospodarski sektorji so precej popularne priprave, pridobljene z zgornjimi metodami. Pristopi, razviti v praksi, zagotavljajo rešitev težav pri izvajanju ciljne dostave zdravil v telesu. Imobilizirani encimi omogočajo pridobivanje dolgotrajnih zdravil z minimalno alergenostjo in toksičnostjo. Zdaj znanstveniki rešujejo probleme, povezane z biokonvercijo mase in energije z uporabo mikrobioloških pristopov. Medtem je tehnologija imobiliziranih encimov tudi pomemben prispevek k delu. Obeti za razvoj so dovolj široki za znanstvenike. Torej, v prihodnosti bi morala biti ena od ključnih vlog v procesu nadzorovanja stanja okolja nova oblika analiz. Zlasti govorimo o bioluminiscenčnih in imunoenzimske metode. Poseben pomen so napredni pristopi pri predelavi lignoceluloznih surovin. Imobilizirane encime je mogoče uporabiti kot ojačevalce šibkih signalov. Aktivni center je lahko pod vplivom nosilca pod ultrazvokom, mehanskim stresom ali dovzetnim za fitokemične transformacije.