Izoelektrična točka proteina in njena definicija. Kaj določa izoelektrično točko proteinov? Zakaj je izoelektrična točka drugačna za različne proteine?

Molekule beljakovin so amfoterne baze, saj vsebujejo proste amino in karboksi skupine. Če je pH raztopine manj kot 7, imajo negativen naboj in pri pH večjem od 7 - pozitiven naboj. Kadar so ti stroški enaki, kar je mogoče doseči, ko se v raztopini ugotovi določena kislost ali alkalnost, se določi tako imenovana izoelektrična točka proteina.

Koncept izoelektrične točke

Beljakovine so sestavljene iz aminokislin. Nekatere od teh spojin (arginin, aspartinska kislina, histidin, glutaminska kislina, lizin) so predstavljeni kot ostanki vsebujejo ionske skupine, t.j. take skupine, ki so sposobni ionizacije. Poleg njih mogoče ionizirati karboksila in alfa-amino skupine se nahajajo na koncih ogljika in dušika polipeptidnih verig. Če je pH 7 ali blizu te ravni, ioniziranem stanju so vse ionske skupine. Ker razdalja od dane vrednosti pH v obe smeri, in prednostno v kisli protein začne prehod na izoelektrično stanje, v katerem je molekula material postane električno nevtralna, število ioniziranih skupin nagiba k nič. PH, pri katerem so proteini prenese na izoelektrično stanje se imenuje izoelektrična točka proteinov (PI).

Fizikalno-kemijska narava beljakovin

Ker sestava proteinov vključuje karboksi in aminske skupine, lahko ločijo tako baze kot kisline. Prosta karboksilna skupina daje pozitivno nabit vodikov ion in COO-anion ob disociaciji. Zaradi tega je vodikov ion vezan na amino skupino, ki karakterizira osnovne lastnosti proteina, kar ima za posledico tvorbo proteinskih delcev z negativnimi in pozitivnimi obremenitvami. Ko se beljakovina doda v kislinsko raztopino, se njegova kislinska disociacija zatakne zaradi pomembne prisotnosti vodikovih kationov. Nasprotno, če je v glavni rešitvi glavna disociacija zavržena zaradi prisotnosti COO anionov.

Prenos skozi beljakovinsko raztopino električnega toka bo povzročil, da se anioni premaknejo proti katodi in kationi na anodo. Pri vseh beljakovinah obstaja določena vrednost pH, pri kateri se ionsko gibanje ne pojavi, ko je tok prenesen. V tem primeru govorimo o enakosti različno usmerjenih ionov in enakosti različnih stopenj (bazičnih in kiselih) v proteinski molekuli, za katero je značilno izoelektrično stanje.

Kot je znano, je voda dipol, zato ima svoje dele okoli proteinske molekule, odvisno od tega, kako je napolnjena. Molekula beljakovin pri izoelektrični točki nima hidrata usmerjene lupine. Če se izvajajo proteinske precipitacije, je najprej treba odstraniti hidrirano lupino z odstranitvijo električnega naboja.

Uporaba IET v industriji

V izoelektrično stanju, nekatere lastnosti raztopine proteina, kot otekanje, viskoznost osmotskega tlaka, svetlobne prepustnosti, imajo minimalno vrednost, medtem ko se doseže lomni količnik in optična gostota, v nasprotju s tem največjo vrednost. Beljakovine izoelektrična točka je lahko empirično določimo z določitvijo odvisnosti raztopine proteina zgornjih lastnosti: pH, položaj ekstremov v grafih pI določeni. V izoelektrično stanju lahko obori kazein, ki se uporablja pri proizvodnji sira in mlečnih izdelkov, za kazein iz posnetega mleka kot surovine v različnih industrijah (kazeinskih lepil, umetno hrano in t. D.). Merjenje pl oceniti kakovost proteina, zlasti produkta iz smetane prisotnosti nečistot. To velja še danes, saj lahko uvedba zeliščnih dodatkov v mlečno osnovo zamenjati del živalskih beljakovin z zelenjavo, ki je cenejši.

Poleg tega se lahko izoelektrična točka beljakovin uporablja pri čiščenju odplak na perutninskih farmah. Tako je glavni delež onesnaženja v klavnici perutninske farme krvne beljakovine. Glede na to, da je IET večine beljakovin v območju s šibko kisline reakcijo medija, se bo najpopolnejša ekstrakcija proteinov pojavila s šibko kislo reakcijo medija pri pH, ki se bo odražala na IET.

Dejavniki, ki vplivajo na IET

Na pl vpliva več dejavnikov. Razmislite, kaj določa izoelektrično točko proteinov. Najprej se ugotovi prevlada aminskih ali karboksilnih skupin kot del proteinske molekule. Večina proteini so močnejše kisline v primerjavi z bazami, tako da pl manj kot 7. Obstaja skupina proteinov, ki so močnejše baze, kot kislin za njihovo pl večja od 7. močna korelacija med izoelektrično točko proteina in vsebnosti ionov soli raztopina. koncentracija beljakovine ne vpliva na aktivno sestavino. Zgoraj navedeni dejavniki pojasniti, zakaj je izoelektrična točka pri različnih proteinov.

Primeri proteinov IET:

• pepsin ima vrednost IET približno 1;
• kazein in želatina - 4,7;
• jajčni albumin - 4,8;
• mucin - 2,7;
• pepsinogen - 3,7;
• albumin - 4,6;
• insulin - 5,3;
• oksihemoglobin - 6,8;
• karboksihemoglobin - okoli 6,9;
• mioglobin - 7,0;
• himotripsin - 8,6;
• citokrom C - 10,5;
• salmin - 12.

IET in njena opredelitev

Vse metode za določanje izoelektrične točke proteinov temeljijo na pripravi puferskih raztopin z drugačnim reakcijskim medijem. V vseh teh raztopinah so postavljene enake uteži proučevanih beljakovin, ki so lahko suhe ali v notranjosti oblika rešitve. Uporabljajo se različne metode za določanje IET. Kako določiti izoelektrično točko proteinov?

Glavne metode za določanje IET so elektroforeza, z minimalno viskoznostjo in povezana z uporabo snovi za dehidracijo. Uporabljajo se lahko tudi nekatere druge metode, kot so določanje stopnje suhega beljaka nabrekanja, hitrost sesanja, vendar so manj natančne in zahtevajo veliko količino beljakovin.

Elektroforeza

Pri uporabi te metode so v napravi nameščeni trakovi kromatografskega ali filtrskega papirja, navlaženi z določeno pufrsko raztopino. Sredi vsakega traku se naredi svinčnik, v katero se s pomočjo pipete nanese ena kapljica raztopine proučevanih beljakovin. Naprava se nato vklopi in električni tok potuje skozi te trakove. Makromolekule se spreminjajo glede na pH puferske raztopine. Če pH presega IET, opazimo negativni naboj makromolekul in obratno.

Če je pH enak IET, se makromolekule postanejo nevtralno nabiti. Po določenem času preneha dobava toka, trakovi papirja se vzamejo iz naprave in posušijo, nato pa se beljakovinski vložki pršijo z ninhidrinom za njihov razvoj. IET je nameščen na puferski raztopini traku papirja, kjer ostane proteinsko mesto na istem mestu, kjer je bila kapljica uporabljena. Po potrebi se ta metoda lahko uporablja za fino frakcioniranje proteinov.

Uporaba drugih metod za določanje IET

Ko so v izoelektričnem stanju, so proteinske molekule manj hidrirane, zato se izoelektrična točka proteina lahko določi z uporabo metode minimalne viskoznosti. Za uporabo, potrebujete viskozimetr. S tem instrumentom se določi relativna viskoznost puferskih raztopin. Molekule proteina v izoelektričnem stanju so zložene, tako da bo najmanjša viskoznost v raztopini, v kateri bo njen pH sovpadal z IET.

Na isti lasti temelji metoda, povezana z delovanjem sredstev za preusmerjanje vode. Kot takšno sredstvo je lahko aceton, eter ali alkohol. Izolacija proteinov iz ustreznih rešitev se lahko pojavi hitreje in bolj popolno, bolj popolno je reakcija okolja IET. Na izoelektrični točki so beljakovinske rešitve nestabilne.

Tako obstajajo različne metode za določanje izoelektrične točke proteina. In jo je treba opredeliti glede na razpoložljivo opremo, materiale, količino beljakovin.

Stabilnost beljakovin v IET

Na izoelektrični točki proteina se odbijajo sile odbijanja med delci beljakovin v makromolekuli, kar povzroči agregacijo teh molekul in beljakovin. To kaže, da so v IET beljakovine nestabilne zaradi izgube polnjenja, kar je dejavnik stabilizacije vodnih proteinskih raztopin. Če beljakovini dodamo kislino ali bazo, se molekule ponovno napolnijo, proteini naredijo prehod v raztopino.

Na koncu

Tako protein izoelektrična točka predstavlja vrednost reakcijskega medija (Ph), po kateri molekula protein enakost ugotovilo različne (negativne in pozitivne) stroškov različnih stopenj in enakosti (osnovna in kisla) disociacije. Na tej točki je protein izgubi stroške in postane nestabilna, ki izhajajo izločki. beljakovinske molekule zloži v trenutku, ko se izvaja neka stroškov, je razširjen v obliki niti.